細胞傳代培養指南

貼壁細胞傳代培養是生物學研究中常常遇到的基本實驗。

一、目的
建議使用以下方案作為 貼壁細胞傳代培養的基本指導。

二、責任
所有經過培訓的實驗室人員都有責任執行并遵守程序的所有方面。管理層有責任驗證執行規定程序的技術方面人員的資格。

三、細胞生物學中常見的名詞定義：

1.類上皮細胞——細胞呈多邊形，尺寸更規則，并以不連續的斑塊附著在基質上生長。

2.成纖維細胞（或成纖維細胞樣）——在基質上生長的細胞看起來細長且雙極，在重度培養中經常形成漩渦。

3.永生或連續細胞系——已適應在培養物中無限期生長的細胞。

4.淋巴母細胞樣 – 球形細胞，通常在懸浮液中生長，不附著在表面上。

5.單層培養系統——主要生長在均勻層中的玻璃或處理過的塑料上的細胞。

6.傳代數——細胞經歷的傳代培養次數。傳代數應與每個亞培養物一起記錄。

7.原代培養——源自有機體并置于合適培養環境中的細胞。

8.衰老——分子和細胞結構的累積變化會隨著時間的推移破壞新陳代謝，導致惡化并最終導致細胞死亡。

9.繼代培養或傳代——去除培養基并將細胞從以前的培養物轉移到新鮮的生長培養基中，使細胞系能夠繼續繁殖。

10.懸浮培養系統 – 培養系統中的自由漂浮細胞。

11.組織培養——從動物或植物中取出細胞、組織或器官，然后置于有利于生長的人工環境進行培養的過程。

四、貼壁細胞傳代培養時需要的實驗室 設備
實驗設備將針對指定用途進行適當設計，并適當放置和安裝以方便操作，包括清潔和維護。實驗室儀器將根據既定程序和時間表進行清潔、消毒、維護和校準。培養培養過程中通常會用到的實驗室儀器如下：

1.移液器，移液槍（rainin）

2.水浴鍋

3.溫度計

4.倒置光學顯微鏡

5.離心機

6.CO2 培養箱，能夠在 5% CO2 的濕潤氣氛下維持 37°C

實驗耗材和實驗試劑
培養容器包含處于健康生長階段的細胞或冷凍保存的細胞，這些細胞在冷凍保存前至少有 90% 的存活率。細胞培養操作中使用的實驗耗材主要包括離心管、培養板、細胞培養瓶、無菌一次性培養皿、細胞培養板、移液器吸頭、一次性移液管、乳膠手套等；液體培養基和添加劑、血清等。還包括實驗室消毒液、細胞培養基、胰蛋白酶、0.4%臺盼藍、抗生素和適當的細胞培養添加劑、不含鈣鎂的平衡鹽溶液、適用于細胞類型的牛血清等

細胞規格
培養物應保持在對數生長期（70-80% 匯合）。培養條件取決于細胞系。所有與細胞培養物接觸的溶液、設備和耗材都必須是無菌的。絕不能同時處理不同的細胞系。在準備不同類型的細胞之間，應徹底清潔所有工作區域。

預防措施
穿戴個人防護裝備。使用適當的無菌技術。

貼壁細胞傳代培養步驟

1. 細胞生長培養基的制備。

A. 檢查與細胞系有關的信息，以確定應使用何種培養基類型、添加劑和建議。遵循制造商對細胞培養容器工作體積的建議。

B. 基礎培養基補充有 5-20% 的牛血清，通常還添加抗生素、生長因子、氨基酸或糖。一旦補充基礎培養基以產生完全培養基，它通常可以在 4°C 下穩定 6 周。

2. 細胞檢查

A. 應經常在顯微鏡下檢查細胞，以確保它們健康并按預期生長。貼壁細胞應主要貼附在燒瓶底部，呈圓形、豐滿或細長的形狀，并在其膜周圍折射光線。檢查與細胞系有關的信息，以確定應使用何種培養基類型、添加劑和建議。遵循制造商對培養容器工作體積的建議。

B. 觀察培養細胞的健康狀況、形態、匯合度百分比、細胞碎片、污染等。

C. 如果細胞大量脫落并且看起來干癟、呈顆粒狀或顏色深，或者它們似乎根本沒有生長，或者看起來已被污染，則丟棄細胞。

3. 拆分比率

A. 分流比可用于確保細胞應為實驗做好準備。查看正在使用的細胞系的指南。如果使用高分流比，一些生長緩慢的細胞可能不會生長。一些快速生長的細胞可能需要高分流比以確保它們不會過度生長。作為一般指南：

A. 1:2 分流應達到 70-80% 匯合，并可在 1-2 天內進行實驗

B. 1:5 分流應達到 70-80% 的融合度，并可在 2-4 天內進行實驗。

B. 如果細胞匯合度低于 70-80% 但需要傳代培養，則應以較低的比例分流，以便以足夠高的密度接種細胞以使其存活。

4. 繼代培養或傳代

A. 從培養容器中取出并丟棄用過的細胞培養基。

B. 使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液清洗細胞。

A. 每 10cm2 培養表面積約 2mL。輕輕地將洗滌液添加到容器與附著的細胞層相對的一側，以避免干擾細胞層。輕輕來回搖動容器數次以清洗細胞層。

B. 從培養容器中取出并丟棄洗滌液。

C. 重復洗滌步驟，共洗滌兩次。

C. 將預熱的解離試劑添加到燒瓶的一側。使用足夠的試劑覆蓋細胞層，每 10cm2 約 0.5ml。輕輕搖動培養容器，使解離試劑完全覆蓋細胞層。

A. 在室溫下孵育培養容器約 2-3 分鐘。實際孵育時間因使用的細胞系而異。難以分離的細胞可置于 37°C 以促進分散。

B. 在顯微鏡下觀察細胞是否脫離。如果細胞分離率低于 90%，則將孵育時間增加幾分鐘，每 30 秒檢查一次解離情況。

a. 分離的細胞呈圓形并處于懸浮狀態。根據細胞系的不同，培養容器可以輕輕敲擊燒瓶的側面。注意：為避免結塊，在胰蛋白酶中不要通過敲擊來攪動細胞。

b. 不要讓細胞在解離培養基中停留超過 10 分鐘。

C. 吸出細胞懸液并轉移到錐形管中。

D. 添加相當于 2 體積的預熱完全生長培養基。通過在細胞層表面上吹打幾次來分散介質。將細胞懸浮液轉移到離解介質中含有細胞的管中。細胞懸浮液可以計數用于冷凍保存，或者細胞可以離心用于傳代培養。

E. 以 200-1000xg 離心細胞 5 到 10 分鐘。離心速度和時間將根據細胞類型而有所不同。

F. 將細胞沉淀重新懸浮在最小體積的預熱完全生長培養基中，并取出樣本進行計數。

G. 將細胞懸液稀釋至細胞系推薦的接種密度或分流比。將適當的體積吸取到新的培養容器中，然后將細胞放回培養箱。

更換培養基

A. 如果細胞在幾天內生長良好但尚未融合，則可能需要更換培養基以補充營養。如果懸浮液中有大量細胞或培養基 pH 值開始變酸，請更換細胞培養基。

B. 將完整培養基加熱至 37°C。小心地從培養容器中吸出培養基并丟棄。更換為新鮮的預熱完全培養基并返回培養箱。

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